4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №

^ 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследовательских работ


4.1.1 Анализ проведённых исследовательских работ и выбор начальной субстанции триходермы для сотворения биопрепарата для ветеринарии

На основании анализа проведённых исследовательских работ изготовлены выводы, что при электрофоретическом исследовании активных 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № фракций находятся белки с молекулярным весом 50 кДа и 60 кДа, что в начальном экстракте триходермы имеются две изоформы L-лизин-α-оксидаза, различающиеся величиной проявляемой активности (набросок 4).

Удалось найти удельную активность изоформ: 27 Е/мг 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № и 3,4 Е/мг, поделить их и дать частичную характеристику. Оказалось, что обе формы в большей степени действуют на L-лизин и в наименьшей степени на L-фенилаланин и некие другие L 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №-аминокислоты.




Набросок 4 - Изоформы фермента экстракта триходермы.

В подготовительных опытах были изучены сорбенты, содержащие L-лизин и гексаметилендиамин в качестве лигандов. Установлено, что эти сорбенты позволяют получить фермент с высочайшим выходом. Но, оксидаза на всех 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № изученных сорбентах удерживалась довольно слабо, хотя хоть какой из их мог быть применен в общей схеме чистки фермента.

В следующих опытах было применено новое мембранное устройство.

Для доочистки и концентрирования фермента оксидазы была 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № использована поочередная непрерывная либо каскадная ультрафильтрация с внедрением наноструктурированых мембран. Выбор размеров пор в мембранах определялся известными из литературы размерами молекул фермента. На первом шаге с внедрением мембраны с размерами пор 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № 0,22 мкм проводилась условная стерилизация раствора и удаление механических примесей. Потом удаляли примеси белком с размером молекул более 500 kDa, после чего проводили более узкую чистку раствора с мембранами 300 kDa и на последней стадии концентрировали 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № фермент и промывали его фосфатным буферным веществом с внедрением мембран с порами наименее 50 kDa . Данный процесс осуществлялся как в каскадном варианте, так и режиме непрерывной проточной фильтрации. Получены схожие результаты с предшествующим 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № вариантом выделения и чистки фермента.

Нами проведён анализ исследования оксидаз L- аминокислот активностей 2-ух экстрактов: экстракта, приобретенного без прибавления метаболитов бактериального происхождения (Вариант №1) и экстракта, приобретенного с прибавления метаболитов 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № бактериального происхождения (Brevibacterium sp., Вариант №2). Результаты проведённого анализа представлены в таблице 1.

Добавление метаболитов бактериального происхождения вызывало повышение активности фермента, как было показано нами ранее в 2,5-2,7 раза, а субстратная специфика оксидазы триходермы, как видно из 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № таблицы, фактически не достаточно изменялась. Это принципиальный вывод позволяет в перспективе использовать метаболиты бактериального происхождения для роста активности оксидазы триходермы.


Таблица 1 - Оксидазные активности L-аминокислот экстрактов триходермы.


L-аминокислота

Относительная активность,%

Вариант 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № № 1

(контроль).

Вариант № 2

(с Brevibacterium sp.,)

L- Лизин

L- Фенилаланин

L- Тирозин

DL- Лейцин

L- Гистидин

L- Метионин

L- Аргинин

L- Цистеин

L- Триптофан

L- Аспарагин

100,0

6,5

1,4

2,5

0,2

0,6

0,7

0

0

0

100,0

8,6

1,9

2,5

0,2

0,6

0,8

*

*

*

Примечание:*-следы оксидазной активности.


Наше внимание было уделено неочищенному экстракту триходермы.

Для ветеринарии на первых шагах сотворения фармацевтической формы 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № решено было использовать в разработке фармацевтической формы зкстракт триходермы. А в следующих шагах перейти к созданию фармацевтической формы с гомогенным ферментом.

С этой целью мы изучили сопутствующие оксидазы L-аминокислот 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № экстракта, критерий их проявления (воздействия рН, концентрации S), Km для каждой оксидазы и термостабильность ферментативной активности.

При исследовании зависимости величин оксидазных активностей от рН среды (картинки 5,6,7) установлено, что L-лизин-, L-фенилаланин- и L 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №-тирозин--окисдазные активности более высоки в кислой зоне (рН 5,8), в то время как оксидазная активность в отношении L-метионина, L-лейцина, L-гистидина и L-аргинина оказалась наибольшей в 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № щелочной зоне (рН 8,4) (картинки 8,9,10,11). Вкупе с тем все 7 исследованных оксидазных активностей были размеренными и довольно высочайшими при физиологических значениях рН среды.




Набросок 5 - L-лизин-α-оксидаза.





Набросок № 6 - L-фенилаланин-α-оксидаза.



Набросок 7 - L-тирозин-α-оксидаза.




Набросок 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № 8 - L-аргинин-α- оксидаза.




Набросок 9 - L-метионин -α- оксидаза.



Набросок 10 - L-лейцин-α- оксидаза.




Набросок 11 - L-гистидин-α- оксидаза.


В следующих опытах нами исследовались зависимости величин оксидазных активностей от концентрации субстрата. Нами установлено, что насыщение L 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №-лизин-α-оксидазы субстратом происходит при 0.1М концентрации L-лизина; величина Кm L-лизин-α-оксидазы составила 1,1110-3М. (набросок 12). Для оксидазных активностей в отношении деструкции L-фенилаланина и L-тирозина было типично 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № насыщение субстратом при 10 и 20мМ (набросок 13), а значения Кm составили соответственно 1,3 10-3М и 0,07 10-3М. Найдено,что лучшая концентрация субстратов в инкубационной консистенции является 120 мМ L-лейцина, 80 мМ L-гистидина, 200 мМ L-аргинина и 200 мМ 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № L-метионина (набросок 14).

Более низкими значениями Кm обладали оксидазные активности в отношении L-аргинина, L-метионина, L-гистидина, L-лейцина. Установлена (таблица 2) высочайшая степень их сродства к субстрату, что является одним 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № из главных требований к ферментам, рекомендуемым к применению в онкологической практике.

В последующих наших исследовательских работах определение оксидазной активности в отношении L-аминокислот проводили в хороших критериях с учётом приобретенных результатов (рН 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №, t, концентрации S).




Набросок 12 - Зависимость величины активности L-лизин-α-оксидазы от концентрации субстрата.




Набросок 13 - Зависимость величины активности оксидаз L-аминокислот.

от концентрации субстрата.

1- L- фенилаланин --оксидазная активность.

2- L-тирозин--оксидазная активность



Набросок 14 - Зависимость величины 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № активности оксидаз L-аминокислот

от концентрации субстрата.

1- L-лейцин--оксидазная активность.

2- L-аргинин--оксидазная активность

3- L-метионин--оксидазная активность

4- L-гистидин--оксидазная активность.


Таблица 2 - Кm главных и сопутствующих оксидазных активностей в отношении ряда L-аминокислот в 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № экстракте триходермы.


Оксидазнае активности в отношении ряда L-аминокислот.

Кm, М(10-3 )

L-Лизин

0,110

L-Фенилаланин

0,300

L-Тирозин

0,070

L-Аргинин

0,006

L-Лейцин

0,004

L-Гистидин

0,004

L-Метионин

0,004


В следующей серии опытов мы изучали термостабильность экстракта триходермы.

Исследование термостабильности экстракта проводили 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № при 80°С и в течении маленького периода термической обработки (таблица 3).

Инкубация экстракта при 80°С приводила к понижению активности L-лизин-α-оксидазы через 150 секунд. Оксидазная активность в отношении L-метионина не определялась через 90 секунд 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №, а в отношении L-фенилаланина и L-тирозина-через 60 секунд. Причём, понижение величин этих активностей происходило с большей скоростью, чем уменьшение L-лизин-α-оксидазной активности.

Понятно, что концентрация ферментов в экстракте 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № невысока по сопоставлению с очищенными ферментными продуктами. Из литературы понятно, что термическая инактивация ферментов прямо пропорциональна их концентрации.

Существенную роль в этом процессе играет необратимая агрегация молекул, сопровождающаяся образованием меж денатурированными молекулами белка 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № дисульфидных мостиков, водородных и других связей).


Таблица 3 - Величина удельной оксидазной активности в отношении L-аминокислот зависимо от длительности термической обработки экстракта гриба при 80°С.


Длительность

термической обработки,

секунды.

Величина удельной оксидазной активности 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №, % к начальной.

L-лиз

L-фен

L-тир

L-арг

D,L-лей

L-гис

L-мет

0

100

100

100

100

100

100

100

30

73

86

88

88

93

62

90

60

53

0

0

63

63

46

53

90

33

0

0

0

0

0

0

120

13

0

0

0

0

0

0

150

0

0

0

0

0

0

0


Не считая того, в экстракте гриба могут находиться вещества, стабилизирующие белковые молекулы и утрачивающиеся в процессе чистки ферментов, к примеру 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №, неорганические соли и соли неких аминокислот. Подразумевают, что высочайшая стабильность оксидаз к процессам тепловой инактивации может быть объяснена также диссоциацией молекул ферментов на субъединицы и следующей необратимой агригацией отдельных субъединиц.

В любом 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № случае, проведённые опыты по термоинактивации ферментов экстракта Trichoderma, позволяют сделать заключение, что изучаемые активности обладает высочайшей устойчивостью к процессам тепловой инактивации и их понижение при термической обработке происходит с разной скоростью.

Во 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта №-2-х из литературы отлично понятно о преимуществах термостабильных и термофильных ферментов в промышленных производственных процессах, к примеру, при получении D-аминокислот из рацемической консистенции.

В третьих экзофермент оксидаза L-аминокислот триходермы способна проявлять энзиматическую активность 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № достаточно в широком спектре температур- до 43° C и выше с маленьким понижением.

Таким макаром, беря во внимание вышеупомянутое полностью понятно, что экстракт гриба триходермы, владеющий диапазоном L-аминоксидазных активностей, может быть 4.1 Результаты теоретических и экспериментальных исследований - Отчет о выполнении 3 этапа Государственного контракта № применен в разработке фармацевтической формы для ветеринарии.



41-detskij-ozdorovitelnij-lager-zhemchuzhina-urguna-pri-mou-oosh-d-urgunovo.html
41-informacionnie-dannie-o-kadrovom-obespechenii-obrazovatelnogo-processa-v-celom-po-uchrezhdeniyu.html
41-kalendarnij-uchebnij-grafik-osnovnaya-obrazovatelnaya-programma-visshego-professionalnogo-obrazovaniya-annotaciya.html